Přípravek Eyeblink

Eyeblink conditioning (EBC) je forma klasického podmiňování, která se široce používá ke studiu nervových struktur a mechanismů, které jsou základem učení a paměti. Postup je relativně jednoduchý a obvykle spočívá v párování sluchového nebo zrakového podnětu (podmíněný podnět (CS)) s eyeblink-vyvolávajícím nepodmíněným podnětem (US) (např. mírný závan vzduchu do rohovky nebo mírný šok). Dospělé organismy zpočátku vyvolávají reflexivní, nepodmíněnou odpověď (UR) (např. mrknutí nebo rozšíření nictitující membrány), která následuje po nástupu USA. Po mnoha CS-US párováních se vytvoří asociace taková, že naučené mrknutí, neboli podmíněná odpověď (CR), nastane a předchází nástupu USA. Velikost učení se obecně měří procentem všech párových CS-US testů, které vedou k CR. Za optimálních podmínek dobře vycvičená zvířata produkují vysoké procento CR (> 90%). Podmínky nutné pro učení očním spojem CR a fyziologické mechanismy, které toto učení řídí, byly studovány u mnoha druhů savců, včetně myší, potkanů, morčat, králíků, fretek, koček a lidí. Historicky byli králíci nejpopulárnějšími výzkumnými subjekty.

Pořadí, v jakém jsou stimuly prezentovány, je důležitým faktorem ve všech formách klasického podmiňování. Forward conditioning popisuje prezentační formát, ve kterém CS předchází USA v čase. To znamená, že z pohledu výzkumného subjektu je prožití USA podmíněno právě prožitím CS. EBC je obvykle, ale ne vždy, vedeno tímto způsobem. Další stimulační eventuality zahrnují zpětné podmiňování, ve kterém USA předchází CS, a simultánní podmiňování, ve kterém jsou CS a US prezentovány současně. V každém případě doba mezi nástupem CS a nástupem US je interstimulační interval (ISI).

Postupy při zpožďování a trasování

V Delay EBC předchází CS nástup nástupu v USA a oba podněty se překrývají a tvoří spolu. V Trace EBC předchází CS nástup v USA a mezi CS offsetem a nástupem v USA je období bez podnětů (stopový interval). Zatímco oba tyto postupy vyžadují mozeček, stopový postup vyžaduje také hipokampus.

Po dodání USA do rohovky oka jsou smyslové informace přenášeny do trojklanného jádra a přenášeny přímo i nepřímo (přes retikulární formaci) do přídavných abducenů a abducenů motorických jader (viz Cranial nerve nucleus). Výstup z těchto jader řídí různé oční svaly, které pracují synergicky, aby vytvořily nepodmíněnou reakci mrknutí na stimulaci rohovky (recenzováno, Christian & Thompson, 2003). Elektromyogramová (EMG) aktivita svalu Orbicularis oculi, která kontroluje uzavírání očních víček, je považována za nejvýraznější a nejcitlivější složku mrkání (Lavond et al., 1990) a je tedy nejčastější behaviorálně závislou proměnnou ve studiích EBC.

Trigeminální jádro také vysílá eferentní výčnělky do dolní olivy (IO), a to představuje cestu USA pro EBC. Kritickou oblastí IO pro podmiňování očního linku je dorzální přídavná oliva (Brodal, 1981), a šplhající vlákna (CF) z této oblasti posílají informace o USA do mozečku (Brodal, Walberg & Hoddevik, 1975; Thompson, 1989). Šplhající vlákna nakonec projektují jak do hlubokých mozečkových jader, tak do Purkyňových buněk (PC) v mozečkové kůře.

Pontinová jádra (PN) mohou podporovat různé CS modality (tón, světlo, atd.) pro EBC, protože přijímají projekce ze sluchových, vizuálních, somatasenzorických a asociačních systémů (Glickstein a kol., 1980; Brodal, 1981; Schmahmann & Pandya, 1989; 1991; 1993). Když je CS tón, přijímají se sluchové informace prostřednictvím kochleárních jader (Steinmetz & Sengelaub, 1992). PN dávají vzniknout mechovým vláknovým (MF) axonům, které nesou informace související s CS (Steinmetz a kol., 1987; Lewis a kol., 1987; Thompson a kol., 1997) do mozečku prostředním mozečkovým pedstrem a končí jak v mozečkových jádrech, tak v granulových buňkách (GR) mozečkové kůry (Steinmetz & Sengelaub, 1992). Granulové buňky dávají vzniknout paralelním vláknovým (PF) axonům, které se synapsují na PC.

CS-US konvergence v Cerebellu

Dvě cerebelární místa CS-US konvergence jsou 1) buňky hluboké nukleární oblasti a 2) PC mozkové kůry. Kromě toho, že přijímají konvergující CS a US vstup přes PN, respektive IO, buňky cerebelárních jader přijímají GABA-ergní inhibiční vstup z PC cerebelární kůry. Výstup z interposituálního jádra zahrnuje projekce do červeného jádra a červené jádro vysílá projekce do jádra obličeje a abducenu. Tato jádra dodávají motorickou výstupní složku reflexivního eyeblinku. Proto kromě toho, že jsou místem stimulační konvergence, jsou hluboká jádra také výstupní strukturou cerebella.

Kritická role Interpositus Nucleus

Profesor Richard F. Thompson a jeho kolegové zpočátku identifikovali mozeček jako základní strukturu pro učení a provádění eyeblink CR. Někteří vědci se domnívají, že jádro Interpositus je kritickým místem pro učení, udržení a provádění reakce na podmiňovací mrknutí.

První důkazy o roli mozečku v EBC pocházejí od McCormicka a kol. (1981). Zjistili, že jednostranná mozečková léze, která zahrnovala jak kůru mozkovou, tak hluboká jádra, trvale zrušila CR. V následných studiích bylo zjištěno, že léze laterálních interposituálních a mediálních jader dentátu byly dostačující k zabránění získání CR u naivních zvířat (Lincoln a kol., 1982) a zrušila CR u dobře vycvičených zvířat (McCormick & Thompson, 1984). A konečně použití Kainových lézí, které ničí těla neuronálních buněk a šetří procházející vlákna, poskytlo důkazy pro vysoce lokalizovanou oblast mozečkových jaderných buněk, které jsou nezbytné pro učení a provádění CR (Lavond a kol., 1985). Populace buněk kritických pro EBC se zdá být omezena na ~ 1 mm3 oblasti dorsolaterální přední INP ipsilaterální k podmíněnému oku. Leze v této oblasti INP mají za následek nemožnost získat oční linky CR u naivních zvířat. Navíc je pozoruhodná trvalost lokalizovaného lézního efektu. U dobře vycvičených zvířat nejsou CR zrušené v důsledku léze znovu získány, a to ani po rozsáhlém výcviku, který trvá déle než 8 měsíců (Steinmetz et al, 1992). Tyto výsledky ukazují, že vysoce lokalizovaná oblast mozečku musí být neporušená, aby se CR učení vyskytlo v EBC.

Studie reverzibilní inaktivace

Reverzibilní inaktivace INP poskytla další důkazy o její roli v EC. Metody používané k dočasné inaktivaci nervové tkáně zahrnují použití chladicí sondy (< 10° C) a lokální infuzi Muscimolu nebo Lidokainu. Tyto metody jsou výhodné především proto, že experimentátor může v podstatě zapínat a vypínat nervovou tkáň jako takovou. Účinek každého z těchto inaktivačních protokolů na učení a provádění CR byl testován v celém mozečku a přidružených strukturách mozkového kmene. Při aplikaci na INP dočasná inaktivace zcela zabraňuje učení CR u naivních zvířat a učení probíhá normálně během tréninku po inaktivaci (Clark et al, 1992; Krupa et al., 1993; Nordholm et al., 1993; Krupa & Thompson, 1997). Navíc inaktivace INP u dobře trénovaných zvířat má za následek úplnou depresi podmíněné odezvy, která se po opětovném zprovoznění INP vrací na úroveň plató (Clark et al., 1992).

Záznamy mnohočetné neuronální aktivity z INP králíka během kondicionování očního linku byly možné pomocí Chronic Electrode Implants a odhalily populaci buněk, které se vybíjejí před iniciací naučené oční linky CR a oheň ve vzorci zvýšené frekvence odezvy, který předpovídal a modeloval časovou formu behaviorální CR (McCormick et al., 1981; 1982; 1983; Thompson, 1983; 1986; Foy et al., 1984; McCormick & Thompson, 1984a; b; Berthier & Moore, 1990; Gould & Steinmetz, 1996). Podobné výsledky byly nalezeny u INP potkana (Freeman & Nicholson, 2000; Stanton & Freemen, 2000; Rogers et al., 2001), čímž se prokázalo, že základní obvody pro tuto formu učení mohou být zachovány napříč druhy. Ačkoli vzorky jednojednotkové aktivity z INP a okolních jader odhalily množství vzorců odezvy během EBC (Tracy, 1995), mnohé buňky v přední dorsolaterální INP významně zvyšují svou rychlost palby v přesném časovém vzorci, který je zpožděn od nástupu CS a předchází nástupu CR (Foy a kol., 1984; Berthier & Moore, 1990). Tento vzorec odezvy svědčí o struktuře, která je schopna kódovat učení a/nebo provádět naučené behaviorální odezvy.

Kritická místa pro vzdělávání v návaznosti?

Předpokládá se, že alternativní místa Synaptické plasticity kritická pro EBC existují po proudu od mozečku. Některé navrhované lokusy zahrnují červené jádro (Tsukahara, Oda, and Notsu, 1981), trojklanné jádro a přidružené struktury (Desmond & Moore, 1983) nebo jádro Faciální motoriky (Woody et al., 1974). Všechny tyto struktury byly vyloučeny jako potenciální místa plasticity kritická pro učení se eyeblink CR (Krupa, Thompson, and Thompson, 1993; Clark and Lavond, 1996; Krupa, Weng, and Thompson, 1996).

Výsledky ze studií lézí, inaktivace a neuronových záznamů dohromady zřejmě prokazují, že dorsolaterální část předního interposituálního jádra (INP) mozečku, ipsilaterální k trénovanému oku, je základním místem pro akvizici a expresi CR v EBC (Lincoln a kol., 1982; Lavond a kol., 1984a,b). Nedávné studie (Nilaweera a kol., 2006) však zjistily, že dočasný blok mozečkového výstupu brání normálnímu získávání podmíněných odpovědí. Autoři dospěli k závěru, že tato forma asociativního učení v systému rabbit eyeblink vyžaduje mimomozečkové učení a/nebo mozečkové učení, které závisí na fungování zpětnovazebních smyček mozečku.

Role mozkové kůry

Dvě oblasti mozkové kůry, o nichž je známo, že se podílejí na podmiňování očního víčka, jsou lobule HVI (Lavond a kol., 1987; Lavond a Steinmetz, 1989; Yeo a Hardiman, 1992) a přední lalok ((ANT) Garcia, Steele a Mauk, 1999). Význam mozečkové kůry v EBC, vzhledem k INP, je předmětem diskuse ve vědecké obci.

Několik studií se pokusilo posoudit roli mozečkové kůry v učení oční linky CR a rané studie se zaměřily na velké aspirační léze mozečkové kůry. Lavond a Steinmetz (1989) zcela odstranili laloky HVI/HVIIa a významné části ANT, ušetřili INP a zjistili významné akviziční deficity. Ve srovnání s kontrolami trvalo zvířatům s lézemi sedmkrát déle, než dosáhla kritéria učení. Významného procenta CR nakonec dosáhli zvířata s kortikálně lézemi, ale CR měli nízkou amplitudu a špatně načasované. A konečně velké léze mozečkové kůry po učení neruší naučené CR (Lavond a kol., 1987). Společným faktorem ve všech těchto studiích kortikální ablace bylo, že části kortexu byly ušetřeny, což umožnilo předpokládat, že jiné oblasti kortexu kompenzovaly ztrátu tkáně.

Klasická kondicionování myšího kmene s deficitem Purkyňových buněk pomohla určit, do jaké míry náhradní oblasti v mozečkové kůře kompenzují poškozené oblasti ve výše zmíněných studiích. Tyto myši se rodí s PC, které odumírají přibližně po 3 týdnech života. Protože PC jsou jediným výstupním neuronem mozkové kůry, tento model účinně léze v celé mozečkové kůře. Výsledky kondicionování byly podobné jako u myší s aspirací na kortikální kůru. Myším trvalo výrazně déle, než vytvořily CR, a načasování a zisk odpovědi byly zkreslené (Chen et al, 1996). Proto, i když jsou oční poruchy učení CR spojeny s lézemi mozečkové kůry, struktura se nakonec nejeví jako nezbytná pro učení nebo retenci CR.

Studie reverzibilní inaktivace

Výsledky ze studií cerebelární kortikální inaktivace jsou podobné těm, které byly hlášeny pro studie lézí. Například Krupa (1993) inaktivoval lobulární HVI s [[GABAA receptor]] agonistou Muscimolem a zjistil významné akviziční deficity, ale zvířata se nakonec poučila. Clark a kol. (1997) tyto výsledky replikovali chladicí sondou v HVI. Attwell, Rahman a Yeo (2001) objevili podobné narušení s inaktivací HVI. Při akvizičním výcviku aplikovali antagonistu AMPA receptoru CNQX do HVI a zjistili, že králíci infuzí CNQX se neučili eyeblink CR. Nicméně infuze CNQX po akvizici retenci neovlivnily. Tyto výsledky jsou matoucí, vzhledem k tomu, že zvířata se nakonec naučila eyeblink CR ve všech ostatních studiích cerebelární kortikální léze a inaktivace. Jedním z důvodů, proč je tento účinek tak silný, může být skutečnost, že Attwell a kol., (2001) cvičili zvířata pouze 4 dny v ISI, která je mimo rozsah, o kterém je známo, že je optimální pro učení [150-300 ms je optimální interval CS-US a velikost učení se snižuje s tím, jak se ISI zvyšuje (Schneiderman a Gormezano, 1964; Smith, Coleman, a Gormezano, 1969)].

Elektrofyziologické záznamové studie mozečkové kůry pomohly lépe pochopit roli, kterou hrají PC v procesu učení eyeblink CR. McCormick a Thompson (1984b) zaznamenali aktivitu PC během tréninku eyeblink a našli buněčné populace, které se vybíjely podle vzorce zřejmě souvisejícího s behaviorální CR, zatímco jiné PC populace se vybíjely podle vzorců, které se shodovaly buď s prezentací CS nebo US. Podobné výsledky našli Berthier a Moore (1986) se záznamem jedné jednotky PC v lobule HVI. Zjistili, že populace neuronů hoří ve vztahu k různým aspektům tréninku eyeblink, včetně CS a US prezentace a provedení CR. (Berthier a Moore, 1986; Gould a Steinmetz, 1996). V poslední době byla podobná aktivita PC spojená se stimulací a odpovědí zjištěna v ANT (Green a Steinmetz, 2005). A konečně, elektrofyziologické záznamy PC v HVI a ANT odhalily rozdíl v celkové populační odpovědi PC. Většina PC vykazuje excitační vzorce aktivity během oční kondicionování u HVI (Berthier a Moore, 1986; Gould a Steinmetz, 1996; Katz a Steinmetz, 1997) a inhibiční vzorce aktivity u ANT (Green a Steinmetz, 2005).

Výsledky ze studií lézí, inaktivace a neuronových záznamů dohromady zřejmě dokazují, že mozečková kůra není nezbytná pro základní učení nebo retenci oční linky CR, ale že významný přínos kůry mozkové je základem normálního učení.

Podkladové synaptické mechanismy EBC

Paralelní vlákno - Synapse Purkyňových buněk

Dlouhodobá deprese (LTD) v synapsi PF-PC má podle hypotézy významné funkční důsledky pro učení se behaviorální CR v EBC (Ito, 1984). Například v důsledku tréninku se buňky INP před provedením CR vybijí a vystřelí ve vzorci zvýšené frekvence odezvy, který předpovídá časovou formu behaviorální CR (McCormick & Thompson, 1984). Tento vzorec aktivity jasně naznačuje, že INP je schopen generovat podmíněnou odezvu. Purkyňovy buňky mozečkové kůry tonicky inhibují hluboké jaderné buňky. Proto by snížení aktivity PC zprostředkované LTD ve vhodnou dobu během CS-US intervalu mohlo uvolnit INP z tonické inhibice a umožnit provedení CR. Zvýšení aktivity PC by mohlo mít opačný účinek, který by provádění CR zakázal nebo omezil. Existuje hypotéza, že CR jsou generovány INP v důsledku uvolnění z inhibice PC (tj. Perrett et al., 1993).